Prošlo je dosta vremena od onog fatalnog jutra 11. rujna 2001. kada su terorističkim djelovanjima napadnuti ciljevi u New Yorku i Washingtonu.
Nakon tog dana stalno se govori da ništa više neće biti kao prije. I tomu je doista tako. Posebice stoga jer se nad svijet nadvila prijetnja uporabe oružja za masovno uništavanje, a u posljednje vrijeme to je osobito aktualno glede biološkog oružja

Za detekciju i identifikaciju bioloških ratnih agensa razvijeno je mnoštvo strategija, no svaka od njih ima neka (nekad velika i znatna) ograničenja.
Godinama se o biološkim agensima razmišljalo kao o oružju koje će biti uporabljeno na nekim “dalekim” bojištima i borbama. Kao rezultat toga, kasnih šezdesetih godina SAD su razvijale program detektora temeljenih na fluorescenciji.
Sve se to promijenilo tijekom 1991. godine u Zaljevskom ratu protiv Iraka. Izvješća tajnih i obavještajnih službi govorila su o tome da je Irak proizveo antraks i botulin toksin, kao biološke agense, te da ih je spreman uporabiti.
Stoga su prije odlaska sve američke postrojbe imale adekvatnu zaštitnu odjeću, antibiotike i cjepiva protiv antraksa i botulizma, a postrojbe su educirane, kako bi znale odgovarajuće postupati na terenu. Nažalost, metode detekcije su u to doba bile ograničene na relativno primitivne uređaje za skupljanje i detekciju bioloških agensa. Primjenjivao se imunološki test uz enzime, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay); jedinstvena frakcija monoklonalnih antitijela u zadovoljavajućoj količini i s dobro definiranim karakteristikama vezivanja u imuno vezivnim kolonama i jednostavni, prenosivi uređaji, koji su se temeljili na antitijelo- kromatografskom odzivu.
Srećom, tijekom Zaljevskog rata 1991. biološki agensi nisu uporabljeni protiv američkih postrojbi, ali je to bio razlog da američko ministarstvo obrane (Department of Defense – DoD) počne s ozbiljnim istraživanjima i pripremama za budućnost.
Zapravo, sovjetski program s biološkim ratnim agensima bio je prijetnja davno prije Zaljevskog rata. Poslije raspada Sovjetskog Saveza, Zapad je saznao i shvatio da su zemlje članice Varšavskog pakta proizvodile detektore nepoznate učinkovitosti i koristile se mobilnim laboratorijama u kojima su provodile klasične testove i testove na životinjama.
Vojni laboratoriji u SAD-u započeli su u to doba razvoj bioloških detektora, kako bi mogli svoje postrojbe upozoriti na vrijeme, i omogućiti im prelazak u uporabu adekvatnih stupnjeva zaštite. Sredinom 90-ih postalo je jasno da je razvoj vremenskih i specifičnih detektora s malim brojem lažnih odziva, teža zadaća nego što se mislilo. Cilj je bio da se što prije detektira(ju) agens(i) kako bi se ranjenima mogla pružiti odgovarajuća skrb. Uspjeh, pa makar manji od očekivanog, olakšao bi trijažu i vjerojatno reducirao potrebe za referentnim laboratorijem tijekom konflikta. Imajući te zahtjeve kao cilj, krenulo se u razvoj nespecifičnih, sustava upravljanih na daljinu, osim razvitka detektora za točno određeni agens.

Što očekujemo da ćemo detektirati?
Tijekom Hladnog rata prijetnja biološkim oružjem bila je limitirana na 15 – 20 klasičnih agensa, koji imaju potrebne biološke i fizikalne karakteristike za taktičku i stratešku uporabu kao oružja.. Detektori, koji se temelje na imuno odzivu bili su početni pokušaj za većinu programa američkog ministarstva obrane, koji su se vodili u smjeru detekcije bioloških agensa. No, detektori temeljeni na reakciji s antitijelima su spori (30- 45 minuta od uzimanja uzorka do detekcije), 10- 15 minuta u optimalnom slučaju.
Da bude još gore, u kasnim devedesetim, spoznaje o tome kako je biološki terorizam moguć, kako se događa tu, kod nas, kako nije imaginaran, širio se i spektar potencijalnih bioloških agensa, iako nisu svi nužno bili letalni.
Zahtijeva se, i za fizikalnu i kemijsku analizu, da se riješi problem vremena i problemi s reagensima, te da se osigura instrument s potencijalno širokim spektrom agensa koje može detektirati, u vojnom i civilnom sektoru. Stoga su, posljednjih nekoliko godina, rezultate, koji su najviše obećavali, pružali neimunokemijski detektori i široka mreža višestrukih imunokemijskih sustava, kojima se smanjuje vjerojatnost krivih odziva. Ipak, čak i uz znatan napredak, osjetljivost i dalje ostaje glavni problem za određenu klasu agensa.
Moguća teroristička prijetnja i civilima i vojsci su glavni biološki agensi, koji su bili poznati tijekom Hladnog rata, agensi uzročnici antraksa, kuge, turaremije, Q – groznice, virusnog encefamijelitisa i velikih boginja, i mnogi agensi koji mogu prouzročiti manju smrtnost, ali potencijalno veći postotak oboljenja i zaraze.
Neki od ovih prijetećih agensa su virus hemoragijske groznice i C. burnetii, koji su visokoinfektivni, a potrebno je svega 1-10 organizama da se inhalira, da bi se oboljelo. Čak i alfa virusi, koji se vrlo lako proizvode, trebaju biti inhalirani u količini od samo 10 – 100 organizama da prouzroče bolest. Za ostale, kao npr. B. anthracis se smatra da je potrebno inhalirati oko 10 000 spora da bi došlo do infekcije.
Uzmimo za primjer pretpostavku da odrastao čovjek udiše 10-100 L/min zraka. Taj je čovjek izložen oblaku s agensom tijekom 20 minuta. Čak i pri niskoj koncentraciji visokoinfektivnog organizma, ta izloženost može dovesti do bolesti. Taj problem “igle u plastu sijena” predstavlja jedan od glavnih izazova u rješavanju osjetljivosti, koja se postavlja pred analitičkog kemičara.
K tome, za razliku od vojske, civilna populacija nije ni procijepljena (pa nema imuniteta), ni dobro pripremljena na biološki napad. Dodatno, detektori bioloških agensa unutar civilne populacije, zbog straha da ne dođe do izbijanja panike među stanovništvom, kao reakcija na već viđene serije i filmove s tom problematikom, moraju odziv držati na apsolutnom minimumu.
Idealni biodetektor trebao bi detektirati bakterijske spore (B. antracis), vegetativne oblike (Y. pestis, F. tularensis), spektar virusa (venecuelanski encefalitis konja i virus variole), i toksine u razini od 150 kDa proteina (botulin) do 300 -Da neproteina (saksitoksin). Iako taj široki spektar analita komplicira detekciju, pažljivom analizom može se usmjeriti na relativno malu skupinu agensa, za koje je rano otkrivanje izimno važno i kritično. Eksperti se općenito slažu da B. antracis, Y. pestis, F. tularensis i virus variole – a svi su oni iznimno patološki – i zahtijevaju poduzimanje medicinskih mjera unutar 24-48 sati poslije izlaganja – moraju biti negdje u vrhu liste agensa za brzu detekciju. U ranom razvoju i testiranju detektora, uglavnom su se rabili simulanti za spore, viruse i proteinske toksine.

Strategija uzorkovanja
Biološki agensi o kojima treba voditi najviše računa su oni koji se šire aerosolno, ili iz jednog centra i izvora biološkog agensa (znači s određene lokacije), odakle se zatim radijalnom difuzijom i rasipanjem agens širi vjetrom. U konačnici, prostor po kojem se agens raširio izgleda kao rašireni dim od cigare. Brod, kamion, ili avion može linearno raznositi biološki agens, obično okomito na smjer vjetra, što rezultira u oštrom, omeđenom obliku koji se širi niz vjetar.
Skupljači uzoraka su nužni, kako bi ugustili relativno mali broj čestica u velikom volumenu zraka, u mali tekući uzorak.
Kolektori kojima se sada koriste, temelje se na različitim filterima, impaktorima i ciklonskoj tehnologiji (usmjeravanje fluidne zračne struje čestica koje se raznose, po tangenti, kako bi one na kraju dobile cirkularno kretanje).
Impaktori su u biti sita za uzorke zraka. Zrak se provlači kroz impaktor, koji se sastoji od niza (serije) paralelnih ploča, koje sadrže rupe različitih veličina, s velikim rupama na pločama na vrhu i malim rupama na nižim pločama. Svaka ta ploča sadrži i Petrijevu zdjelicu, u koju se usmjeravaju i “love” čestice određene veličine. Manje čestice prolaze u zračnoj struji prema kolektorima na sve nižoj i nižoj razini. Na taj način živi mikroorganizmi počinju rasti na Petrijevoj zdjelici, na onoj razini, koja ih omeđuje njihovom veličinom. To nije brza metoda, nego metoda koja zahtijeva vrijeme, tijekom kojeg dolazi do rasta mikroorganizama, koji se zatim detektiraju i broje.
Kod ciklona, rotirajući tekući sloj skuplja čestice zraka, kako one ulaze u skupljač uzoraka, omogućavajući na taj način relativno vrlo učinkovito skupljanje uzoraka zraka u otopini. Stotine do tisuće litara zraka po minuti skupljaju se i ugušćuju u malim volumenima tekućine. Na taj način, čak i kod niskih koncentracija aerosola, stotine ili tisuće čestica mogu biti “ugušćene” u nekoliko mililitara tekućine. Taj se vodeni uzorak zatim odnosi u sustav za detekciju.
Strategije detekcije
Metode koje su sada u uporabi temelje se ili na detekciji čestica ili na imunokemiji. Detektori čestica su tako napravljeni da mogu odrediti veličinu čestica i prema njihovom obliku i naznakama procijeniti da je riječ o biološkom agensu. Općenito, oni ne detektiraju određeni biološki agens, nego gledaju povećan broj čestica u zraku. Mogu biti primijenjene i neke druge strategije detekcije, koje se temelje na raspršenju ili apsorpciji dnevnog svjetla, apsorbanciji na određenoj valnoj duljini, ili fluorescenciji čestica. Ključ za dobru metodu je razlikovanje kada je došlo do određenih čestičnih promjena, i procjene da je doista došlo do primjene bioloških agensa, a ne jednostavno do pojavljivanja nekih nepatogenih mikroba (iste veličine, kao što su npr. pelud ili prašina).
Svi biološki sustavi sadrže amino kiseline, kao što su npr., triptofan, koja apsorbira u UV području; biološki agensi mogu se detektirati i razlikovati od anorganskih čestica uporabom UV lasera.
Najuobičajeniji sustavi za identifikaciju temelje se na imunokemiji i postoje u različitim veličinama, oblicima, a mogu se okarakterizirati kao jednostavni, jednostavni za uporabu, jednostavni za rukovanje – do velikih, analitičkih, laboratorija “na kotačima”. Jedan od takvih sustava je Biological Integrated Detection system (BIDS), koji je razvio Razvojni sektor Ministarstva obrane SAD-a.

Sustav BIDS
BIDS je biokemijski laboratorij na kotačima, koji se može transportirati i avionom, pa tako zapravo može biti u uporabi gotovo svugdje. Zahtijeva generator vlastite energije, a postavlja se na robustnija vozila s pogonom na sva četiri kotača. U uporabi je na terenu od 1996. godine. Osnovni BIDS je bio takav da je u 45 minuta mogao detektirati i upozoriti na prisutnost 4 biološka agensa na relativno širokom području.
Sadašnji sustav s poboljšanjima (P 31) sadrži specijalno stvoren biodetektor koji može detektirati sve postojeće biološke agense u manje od deset minuta, identificirati simultano bilo koji od osam agensa u manje od 30 minuta, skupiti uzorke, kako bi se mogla napraviti potvrda analize u “pravom” laboratoriju i izvijestiti o rezultatima zvučnim prijenosom.
Kod rada s BIDS-om, uz UV aerodinamički uređaj za određivanje veličine čestica (APS- aerodynamic particle sizer), čestica određene veličine pokreće uređaj za skupljanje, u trenutku kada se detektiraju čestice veličine od 1 – 10 mikrona, što su čestice tipične veličine za biološke agense. APS je u biti analizator leta čestice u vremenu (TOF- time of flight), i mjeri koliko treba različito velikim česticama da prođu neku određenu razdaljinu. Kroz upuhivač se upuhuje zrak, kako bi stvarao određeni, jasno definirani protok zraka. Kako čestica putuje u struji (mlazu) zraka, ona se usmjerava iz dva položaja s razdvojenom laserskom zrakom. Fotomultiplikator snima signal i vrijeme koje je potrebno za prolazak tog puta, i obavlja proračune, mjerenja i određivanja prema veličini čestice. Detekcijom čestice pokreće se i impaktor.
Nakon skupljanja, tekućina koja sadrži uzorak se razdjeljuje na nekoliko uređaja. Luminiscencija se određuje detektiranjem uzorka UV svjetlom. Emisijski spektar različitih komponenti u čestici, pokazuje prisutnost biološkog agensa. Uzorak se zatim šalje na daljnju ručnu obradu, uz potenciometrijske pH senzore, koji svjetlosno reagiraju na načelu imuno odgovora (LAPS-light-adressable potenciometric pH sensor), pri čemu se svjetlost rabi za aktiviranje i stvaranje osjetljive površine.
Kod ELISA testova se primjenjuje ureaza, kao markirani enzim. Kada ureaza dođe u dodir s ureom, promijeni se pH sredine, i registrira s LAPS senzorom, a što je u korelaciji s određenim biološkim agensom.
Druga frakcija uzorka tretira se s obilježenim nukleinskim kiselinama, i to nekoliko posebnih, a tada se to šalje u citometar.
DNA otisci razlikuju žive od neživih čestica; specifični otisci mogu tako identificirati određene biološke agense. P31 će sadržavati UVAPS, tekući uzorak, mini-citometar, i kemijsko biološki spektrometar masa.
BIDS zahtijeva okidač (za početak) od analizatora čestica po veličini, i on ne analizira kontinuirano. Može, dakako, kontinuirano skupljati i analizirati spremljene uzorke kasnije. Takav je sustav prikladan za analize u borbenom djelovanju, no može biti ne potpuno, ili manje prihvatljiv, zbog visokih troškova, potreba za stalnim održavanjem i (ipak) čestim krivim uzbunama, za analize u civilnim uvjetima, posebice u velikim centrima, gdje bi također trebao biti signal za biološku opasnost.
Interim Biological Agent Detector (IBAD), sustav razvijen za analiziranje mora, je pojednostavljena verzija BIDS-a. IBAD treba povišenu koncentraciju čestica (koja se usisava) da bi se aktivirao ciklonski kolektor. Ta je koncentracija dostatna da se uzorak prenese do vojnog seta (kita) za biouzorkovanje. IBAD može u roku 15 minuta identificirati 8 bioloških agensa. Dosad se zna dvadesetak različitih (a ipak sličnih) sustava koji se primjenjuju za takvu analizu.
Long-ranged Biological Standoff Detection System (LR-BSDS) je brzi, kontinuirani sustav za aerosolnu detekciju stvoren za davanje brzog upozorenja; on upozorava ostale biološke sustave o mogućem aerosolu, do daljine od 50 km. Za svoju detekciju koristi se IR (infra crvenom) spektroskopijom. Može odrediti koncentraciju, raspon, mjesto i put aerosolnog oblaka, ali ne i identificirati sastojke oblaka. Stoga je LR-BSDS stvoren da upozori i alarmira osoblje o neuobičajenim oblacima, koji mogu biti biološka prijetnja. U uporabi je od 1996. godine.

Treći sustav je Portal Shield, “point” detektor, koji je zaštita za fiksno određena mjesta, kao što su luke ili zračne luke. Sustav je približno veličine dvije trećine veličine običnog radnog stola i simultano može detektirati osam bioloških agensa. Uz njegovu pomoć smanjuje se i mogućnost lažne uzbune.
Portal Shield koristi se imunokromatografskim testom, zvanim ručni test (hand-held assay- HHA). Priređuju se tekući uzorci s imunoreagensima, koji su naneseni na čvrstu podlogu, slično kao test za kućnu detekciju trudnoće. Uzorak se pomiče kroz tu podlogu zbog kapilarnih sila. Imunofokusiranjem na antitijela, koja su označena koloidnim zlatom, antigen stvara crvenu liniju, koja se detektira refleksijom.
Sa svakim testom se može napraviti analiza za točno određeni biološki agens. Stoga, ako se sumnja na više agensa, uzorak se mora razdijeliti i napraviti više testova. Portal Shield koristi se automatiziranim sustavom za uzorkovanje i testiranje. Rezultati testa se očitavaju laserskim pretraživačem. Većina imunotestova nije reverzibilna, te stoga ti testovi nisu višestruko uporabljivi. Sustav može identificirati simultano šest do osam agensa u dvadesetak minuta.
Općenito, osjetljivost tih testova je znatno niža od konvencionalnih testova koji se temelje na imunokemijskim tehnikama, s izuzetkom onih koji su razvijeni da detektiraju toksine. Drugo ograničenje je u diskontinuiranoj prirodi analize. Diskretni uzorci se analiziraju, te stoga učestalost analiza mora biti vrlo velika, kako bi mu se izbjeglo produženo izlaganje, kada agens dođe u područje analize. Ipak, Portal Shield pruža visok stupanj fleksibilnosti u analizi bioloških agensa i posebice kod sumnje na određene agense. Tijekom Zaljevskog rata, službeno se smatralo da Irak posjeduje određene biološke agense.
Canadian Integrated Biochemical Agent Detection System (CIBADS II) je automatizirani sustav koji sadrži aerodinamički fluorescentni analizator čestica (FLAPS- fluorescence aerodynamic particle sizer) koji može razlikovati žive od neživih čestica. Sljedeća generacija verzije CIBADS II je 4WARN, koji je manji, lakši, za rad mu je potrebna manja snaga i sadrži snažnije algoritme, kojima se reducira brzina i učestalost lažnih alarma.

Ankica ČIŽMEK